常见问题

mNGS技术的核心是测定核酸分子的碱基序列，除不含核酸的蛋白病毒-朊病毒外，寄生虫、真菌、细菌、非典型病原体、DNA病毒及RNA病毒均可通过NGS技术检测。

1.      避免使用干扰PCR反应的耗材，如肝素抗凝管。

2.      采样时确保能采集到病原微生物所在的感染部位。

3.      采样时避免环境微生物污染。

影响。标本量的多少决定了标本中病原微生物的含量。当标本量过少时，标本中病原微生物的含量可能低于该技术的检测限，导致该样本中的病原微生物不能被正常检出。

理论上DNA病原体和RNA病原体可同时检测。检测流程需要同时对样本中的DNA和RNA进行提取，其中RNA经过额外处理后变成DNA，将全部DNA进行二代测序文库构建，即可以实现同时对DNA病原体和RNA病原体的共检测。

核酸提取时，不同的前处理条件对不同病原体的核酸提取效率影响不同，如真菌类病原体需通过物理或化学处理提高细胞壁的裂解，以增加检出，但这些操作可能导致RNA降解，影响RNA病毒检出。所以需要分别进行处理再合并文库构建和上机测序。

如果同时检测DNA流程与RNA流程，总数据量应为单一检测流程的两倍，才能维持相同的灵敏度。（例如单一流程为20M数据量，那么共检DNA和RNA的流程数据量为40M）。如果总数据量不变，就会导致灵敏度降低。

1.      样本中提取的交叉污染、PCR扩增引起的气溶胶污染，会导致假阳性结果，故此在临床应用中需要有严格的实验分区、实验室管理及质量控制措施；

2.      样本采集/保存、运输及处理不当、未按说明书操作均有可能导致假阳性或假阴性结果。如，采集样本时未充分消毒，可能导致皮肤定植菌入样本，导致假阳性；组织样本取样偏离感染部位，可能导致检出假阴性。

3.      样本中病原体浓度低于检出限可能造成假阴性结果；

4.      数据量给定时，一份标本中人源背景核酸越多，微生物核酸的占比越少，此种情况下也可能导致假阴性。

5.      样本本身的低质量序列、物种的错误注释、来自于人源序列/接头序列/载体等污染。

采用基因组水平的数据库进行鉴定，物种鉴定准确度更高，一定程度上可降低假阳性和假阴性。

1.      细菌和病毒的基因组较小，构成不太复杂，绝大多数是完整基因组水平。

2.      真菌和寄生虫基因组大，构成复杂，组装难度高，大部分处于Scaffold或Conting水平。

3.      Scaffold或Conting虽不是完整基因组水平，但含有绝大多数基因组序列，只有少数未知序列，可以进行物种鉴定。

常规裂解液对细胞壁较厚的胞内菌/真菌的细胞壁裂解效率低，导致核酸释放量较少，从而影响胞内菌和真菌的检出。

全基因组测序（WholeGenome Sequencing， WGS）：分离单独菌株，采用WGS测序，进行高分辨率分子流行病学，新病原体发现，毒力/耐药基因应用；

靶向扩增测序（Targeted amplicon sequencing）:不需培养，需要假设细菌或者真菌，鉴定细菌采用16SRNA测序，鉴定真菌采用真菌18SRNA测序；

红基因组测序（metagenomic sequencing, mNGS）:不需要培养，不需要假设，无偏性检测细菌，真菌，病毒，寄生虫等病原。

胞外菌寄居在宿主细胞外，胞外菌感染时病菌主要位于宿主细胞外的血液、淋巴液、组织液等体液中。

大多数的致病菌都是胞外菌，主要致病机制是外毒素、内毒素等毒性物质引起局部化脓性炎症。常见的胞外菌主要有葡萄球菌、链球菌、奈瑟菌、淋球菌、厌氧芽孢梭菌和多种革兰氏阴性杆菌。

胞内菌分为兼性胞内菌和专性胞内菌。

兼性胞内菌指在宿主体内主要寄居在细胞内生长繁殖，也可在体外无细胞的适宜环境中生存和繁殖，如结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、伤寒沙门菌、嗜肺军团菌、布鲁氏菌、李斯特菌等。

结核分枝杆菌符合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC）主要包括：结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum）、卡内蒂分枝杆菌（Mycobacterium canettii）、田鼠分枝杆菌（Mycobacterium micro提、山羊分枝杆菌（Mycobacterium caprae）等。

MTC属于胞内感染菌，不易释放到细胞外。血浆样本检测的是游离核酸，其载量很低，而肺泡灌洗液、脑脊液等其他样本，虽经破壁处理，但相对于其他细菌来说，其释放的游离核酸仍相对较少，检出序列数一般较低。此外，MTC的种间基因组相似很高，因此种水平的严格比对序列数往往为0。

结果判断时建议查看结核分枝杆菌复合群水平检出情况：

1） 结核分枝杆菌复合群水平序列数≥1条，有一定提示意义；

2） 复合群水平序列数≥3条，有较强提示意义；

3） 以上均需要结合临床及其他检测结果等做综合判断。